ຢາຂ້າແມ່ທ້ອງ N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) ໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າຍັບຍັ້ງ AChE (acetylcholinesterase) ແລະມີຄຸນສົມບັດເປັນມະເຮັງທີ່ອາດເກີດຂື້ນຍ້ອນການເກີດເສັ້ນເລືອດຫຼາຍເກີນໄປ. ໃນເອກະສານນີ້, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DEET ໂດຍສະເພາະກະຕຸ້ນຈຸລັງ endothelial ທີ່ສົ່ງເສີມ angiogenesis, ດັ່ງນັ້ນການເພີ່ມການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເນື້ອງອກ. DEET ກະຕຸ້ນຂະບວນການ cellular ທີ່ນໍາໄປສູ່ angiogenesis, ລວມທັງການຂະຫຍາຍຕົວ, ການເຄື່ອນຍ້າຍ, ແລະການຍຶດຕິດ. ນີ້ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບການຜະລິດ NO ເພີ່ມຂຶ້ນແລະການສະແດງອອກ VEGF ໃນຈຸລັງ endothelial. ການງຽບຂອງ M3 ຫຼືການໃຊ້ຢາຍັບຍັ້ງ M3 ທາງຢາໄດ້ຍົກເລີກຜົນກະທົບເຫຼົ່ານີ້ທັງຫມົດ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ angiogenesis DEET-induced ແມ່ນ M3-sensitive. ການທົດລອງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການໃຫ້ສັນຍານດ້ວຍທາດການຊຽມໃນຈຸລັງ endothelial ແລະ HEK ທີ່ overexpressing M3 receptors, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການສຶກສາການຜູກມັດແລະ docking, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ DEET ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນໂມດູນ allosteric ຂອງ M3 receptors. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, DEET ຍັບຍັ້ງ AChE, ດັ່ງນັ້ນການເພີ່ມຊີວະພາບຂອງ acetylcholine ແລະການຜູກມັດຂອງມັນກັບ M3 receptors, ແລະເສີມຂະຫຍາຍຜົນກະທົບ proangiogenic ຜ່ານລະບຽບການ allosteric.
ECs ປະຖົມໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກ aorta ຂອງຫນູສະວິດ. ວິທີການສະກັດເອົາໄດ້ຖືກດັດແປງຈາກອະນຸສັນຍາ Kobayashi 26 . Murine ECs ໄດ້ຖືກປູກຝັງຢູ່ໃນຂະຫນາດກາງ EBM-2 ເສີມດ້ວຍ FBS ທີ່ບໍ່ມີຄວາມຮ້ອນ 5% ຈົນກ່ວາ passage ສີ່.
ຜົນກະທົບຂອງສອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ DEET ຕໍ່ການຈະເລີນເຕີບໂຕຂອງ HUVEC, U87MG, ຫຼື BF16F10 ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). ໂດຍຫຍໍ້, 5.103 ເຊລຕໍ່ດີໄດ້ຖືກແກ່ນໃນແຜ່ນ 96 ດີ, ອະນຸຍາດໃຫ້ຕິດຄ້າງຄືນ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນປິ່ນປົວດ້ວຍ DEET ເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງ. ຫຼັງຈາກການເອົາຂະບວນການຂະຫຍາຍຕົວອອກ, ຕື່ມການແກ້ໄຂການຜູກມັດສີຍ້ອມຜ້າໃສ່ແຕ່ລະດີຂອງ microplate ແລະ incubate ຈຸລັງຢູ່ທີ່ 37 ° C ສໍາລັບການ 30 ນາທີ. ລະດັບ fluorescence ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ຕົວອ່ານ microplate Mithras LB940 multimode (Berthold Technologies, Bad Wildbad, ເຢຍລະມັນ) ທີ່ມີຕົວກອງຄວາມຕື່ນເຕັ້ນ 485 nm ແລະການກັ່ນຕອງການປ່ອຍອາຍພິດ 530 nm.
HUVEC ໄດ້ຖືກນໍາໄປຝັງຢູ່ໃນ 96 ແຜ່ນທີ່ມີຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ 104 ເຊນຕໍ່ດີ. ຈຸລັງໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ DEET ເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງ. ຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງເຊນໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍໃຊ້ colorimetric MTT assay (Sigma-Aldrich, M5655). ຄ່າຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ optical ໄດ້ຮັບໃນເຄື່ອງອ່ານ microplate multimode (Mithras LB940) ຢູ່ທີ່ຄວາມຍາວຂອງຄື້ນ 570 nm.
ຜົນກະທົບຂອງ DEET ໄດ້ຖືກສຶກສາໂດຍໃຊ້ in vitro angiogenesis assays. ການປິ່ນປົວດ້ວຍ 10-8 M ຫຼື 10-5 M DEET ເພີ່ມການສ້າງຄວາມຍາວຂອງ capillary ໃນ HUVECs (ຮູບ 1a, b, ແຖບສີຂາວ). ເມື່ອປຽບທຽບກັບກຸ່ມຄວບຄຸມ, ການປິ່ນປົວດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ DEET ຕັ້ງແຕ່ 10-14 ຫາ 10-5 M ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມຍາວຂອງ capillary ບັນລຸລະດັບພູພຽງຢູ່ທີ່ 10-8 M DEET (ຕື່ມ Fig. S2). ບໍ່ພົບຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສໍາຄັນໃນຜົນກະທົບ in vitro proangiogenic ຂອງ HUVECs ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ DEET ໃນລະດັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ 10-8 M ແລະ 10-5 M.
ເພື່ອກໍານົດຜົນກະທົບຂອງ DEET ກ່ຽວກັບ neovascularization, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດໃນການສຶກສາ vivo neovascularization. ຫຼັງຈາກ 14 ມື້, ຫນູທີ່ສັກຢາດ້ວຍຈຸລັງ endothelial precultured ດ້ວຍ 10-8 M ຫຼື 10-5 M DEET ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການເພີ່ມຂື້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງເນື້ອໃນ hemoglobin (ຮູບ 1c, ແຖບສີຂາວ).
ນອກຈາກນັ້ນ, ການສຶກສາ neovascularization ທີ່ຖືກກະຕຸ້ນໂດຍ DEET ໃນຫນູ U87MG xenograft-bearing ທີ່ໄດ້ຮັບການສັກຢາປະຈໍາວັນ (ip) ດ້ວຍ DEET ໃນປະລິມານທີ່ຮູ້ຈັກເພື່ອກະຕຸ້ນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ plasma ຂອງ 10-5 M, ເຊິ່ງເປັນເລື່ອງປົກກະຕິໃນມະນຸດທີ່ຖືກເປີດເຜີຍ. ໃນ 23. ເນື້ອງອກທີ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ (ເຊັ່ນ: ເນື້ອງອກ > 100 mm3) ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນ 14 ມື້ຫຼັງຈາກການສັກຢາ U87MG ເຊນໃສ່ຫນູ. ໃນມື້ 28, ການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເນື້ອງອກໄດ້ຖືກປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນຫນູທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ DEET ເມື່ອທຽບກັບຫນູຄວບຄຸມ (ຮູບ 1d, ສີ່ຫລ່ຽມ). ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, CD31 staining ຂອງ tumors ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DEET ເພີ່ມພື້ນທີ່ capillary ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍແຕ່ບໍ່ແມ່ນຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ microvessel. (ຮູບ 1e–g).
ເພື່ອກໍານົດບົດບາດຂອງ receptors muscarinic ໃນການຂະຫຍາຍພັນຂອງ DETA-induced, 10-8 M ຫຼື 10-5 M DETA ໃນທີ່ປະທັບຂອງ pFHHSiD (10-7 M, ທາງເລືອກ M3 receptor antagonist) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້. ການປິ່ນປົວຂອງ HUVEC. pFHHSiD ສະກັດກັ້ນຄຸນສົມບັດການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ DETA ຢ່າງສົມບູນໃນທຸກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ (ຕາຕະລາງ 1).
ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂເຫຼົ່ານີ້, ພວກເຮົາຍັງໄດ້ກວດເບິ່ງວ່າ DEET ຈະເພີ່ມຄວາມຍາວຂອງເສັ້ນເລືອດໃນຈຸລັງ HUVEC. ເຊັ່ນດຽວກັນ, pFHHSiD ປ້ອງກັນຄວາມຍາວຂອງເສັ້ນປະສາດທີ່ເກີດຈາກ DEET ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບ 1a, b, ແຖບສີຂີ້ເຖົ່າ). ນອກຈາກນັ້ນ, ການທົດລອງທີ່ຄ້າຍຄືກັນໄດ້ຖືກປະຕິບັດກັບ M3 siRNA. ເຖິງແມ່ນວ່າ siRNA ຄວບຄຸມບໍ່ມີປະສິດທິພາບໃນການສົ່ງເສີມການສ້າງ capillary, ການງຽບຂອງ receptor M3 muscarinic ຍົກເລີກຄວາມສາມາດຂອງ DEET ເພື່ອເພີ່ມຄວາມຍາວຂອງ capillary (ຮູບ 1a, b, ແຖບສີດໍາ).
ນອກຈາກນັ້ນ, ທັງສອງ 10-8 M ຫຼື 10-5 M DEET-induced vascularization in vitro ແລະ neovascularization ໃນ vivo ໄດ້ຖືກສະກັດຢ່າງສົມບູນໂດຍ pFHHSiD (ຮູບ 1c, d, ວົງ). ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ DEET ສົ່ງເສີມ angiogenesis ໂດຍຜ່ານເສັ້ນທາງທີ່ລະອຽດອ່ອນກັບ M3 receptor antagonists ຫຼື M3 siRNA ທີ່ເລືອກ.
AChE ແມ່ນເປົ້າຫມາຍໂມເລກຸນຂອງ DEET. ຢາເຊັ່ນ: donpezil, ເຊິ່ງເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນສານຍັບຍັ້ງ AChE, ສາມາດກະຕຸ້ນ EC angiogenesis ໃນ vitro ແລະໃນຫນູ hindlimb ischemia model14. ພວກເຮົາໄດ້ທົດສອບຜົນກະທົບຂອງສອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ DEET ໃນກິດຈະກໍາຂອງເອນໄຊ AChE ໃນ HUVEC. ຕ່ໍາ (10-8 M) ແລະສູງ (10-5 M) ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ DEET ຫຼຸດລົງກິດຈະກໍາ endothelial AChE ເມື່ອທຽບກັບເງື່ອນໄຂການຄວບຄຸມ (ຮູບ 2).
ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ DEET ທັງສອງ (10-8 M ແລະ 10-5 M) ຫຼຸດລົງກິດຈະກໍາ acetylcholinesterase ໃນ HUVEC. BW284c51 (10-5 M) ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມສໍາລັບ acetylcholinesterase inhibitors. ຜົນໄດ້ຮັບແມ່ນສະແດງອອກເປັນອັດຕາສ່ວນຂອງກິດຈະກໍາ AChE ໃນ HUVEC ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ DEET ທັງສອງທຽບກັບຈຸລັງທີ່ປິ່ນປົວດ້ວຍຍານພາຫະນະ. ມູນຄ່າສະແດງອອກເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± SEM ຂອງຫົກການທົດລອງເອກະລາດ. *p < 0.05 ເມື່ອປຽບທຽບກັບການຄວບຄຸມ (Kruskal-Wallis ແລະ Dunn ຫຼາຍການທົດສອບປຽບທຽບ).
Nitric oxide (NO) ມີສ່ວນຮ່ວມໃນຂະບວນການ angiogenic 33, ດັ່ງນັ້ນ, ບໍ່ມີການຜະລິດໃນ HUVECs ທີ່ກະຕຸ້ນ DEET ໄດ້ຖືກສຶກສາ. ການຜະລິດ endothelial NO ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ DEET ແມ່ນເພີ່ມຂຶ້ນເມື່ອທຽບກັບຈຸລັງຄວບຄຸມ, ແຕ່ບັນລຸຄວາມສໍາຄັນພຽງແຕ່ໃນປະລິມານ 10-8 M (ຮູບ 3c). ເພື່ອກໍານົດການປ່ຽນແປງໂມເລກຸນທີ່ຄວບຄຸມການຜະລິດ DEET-induced NO, ການສະແດງອອກ eNOS ແລະການກະຕຸ້ນໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍການ blotting ຕາເວັນຕົກ. ເຖິງແມ່ນວ່າການປິ່ນປົວ DEET ບໍ່ໄດ້ປ່ຽນແປງການສະແດງອອກຂອງ eNOS, ມັນໄດ້ເພີ່ມ eNOS phosphorylation ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຢູ່ທີ່ສະຖານທີ່ກະຕຸ້ນຂອງມັນ (Ser-1177) ໃນຂະນະທີ່ຫຼຸດລົງສະຖານທີ່ inhibitory ຂອງມັນ (Thr-495) ເມື່ອທຽບກັບຈຸລັງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວໃນ eNOS phosphorylation (ຮູບ 3d). ນອກຈາກນັ້ນ, ອັດຕາສ່ວນຂອງ phosphorylated eNOS ໃນສະຖານທີ່ກະຕຸ້ນແລະສະຖານທີ່ inhibitory ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ຫຼັງຈາກເຮັດໃຫ້ປະລິມານຂອງ phosphorylated eNOS ປົກກະຕິກັບຈໍານວນທັງຫມົດຂອງ enzyme. ອັດຕາສ່ວນນີ້ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ HUVECs ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ DEET ແຕ່ລະຄົນທຽບກັບຈຸລັງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (ຮູບ 3d).
ສຸດທ້າຍ, ການສະແດງອອກຂອງ VEGF, ຫນຶ່ງໃນປັດໃຈ proangiogenic ຕົ້ນຕໍ, ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ blotting ຕາເວັນຕົກ. DEET ການສະແດງອອກ VEGF ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ໃນຂະນະທີ່ pFHHSiD ສະກັດກັ້ນການສະແດງອອກນີ້ຢ່າງສົມບູນ.
ເນື່ອງຈາກຜົນກະທົບຂອງ DEET ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ກັບທັງການສະກັດກັ້ນທາງຢາແລະການຫຼຸດລົງຂອງ receptors M3, ພວກເຮົາໄດ້ທົດສອບສົມມຸດຕິຖານວ່າ DEET ອາດຈະເພີ່ມສັນຍານຂອງທາດການຊຽມ. ເປັນເລື່ອງແປກທີ່, DEET ລົ້ມເຫລວໃນການເພີ່ມທາດແຄຊຽມ cytoplasmic ໃນ HUVEC (ຂໍ້ມູນບໍ່ໄດ້ສະແດງ) ແລະ HEK/M3 (ຮູບ 4a, b) ສໍາລັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທັງສອງທີ່ໃຊ້.
ເວລາປະກາດ: 30-12-2024